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谷氨酰胺(Glutamine, Gln)含量测定试剂盒说明书

                             分光光度法 50管/48样 

 谷氨酰胺(Glutamine)分光光度法测定试剂盒

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

谷氨酰胺（Glutamine）是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一。是人体内最普遍的、不可缺乏的条件性必需氨基酸，是构成蛋白质不可缺少的氨基酸之一，更是某些细胞培养中最基本的元素。由于谷氨酰胺不稳定的特性，在细胞培养基的整合中，易自发性分解为谷氨酸和氨离子，而氨离子对细胞的毒性很强，因此，在细胞培养体系中，须密切关注谷氨酰胺的储存寿命（SHELF LIFE）和实时监测。

测定原理：

在谷氨酰胺酶（Glutaminase）作用下，谷氨酰胺发生脱氨基反应，产生谷氨酸（glutamic acid）和氨离子；

 谷氨酰胺+H₂O———————谷氨酸+NH₄⁺

然后用显色剂进行显色，显色后在570nm下进行测定。

  谷氨酰胺(Glutamine)分光光度法测定试剂盒

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体50mL×2瓶，4℃保存；

试剂二：液体1.5ml×1瓶，-20℃保存；

试剂三，粉剂×1瓶， 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀溶解，用不完的试剂仍 4℃保存

谷氨酰胺提取：

1、细菌或培养细胞样品：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议1000万细菌或细胞加入2mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.2g组织，加入2mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）或细胞培养液样品：按照血清（浆）或细胞培养液体积（mL）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.2mL血清（浆）或者细胞培养液加入2mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

 谷氨酰胺(Glutamine)分光光度法测定试剂盒

测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 在有盖EP管中加入下列试剂：

混匀，37℃水浴30min（盖紧，以防止水分散失），

90℃水浴20min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却，于570nm波长处比色，
△A=A测定管 - A对照管1 - A对照管2。对照管2只要做一管。

谷氨酰胺含量计算：

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0074x- 0.5255；x为谷氨酰胺含量（µg/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）或者细胞培养液体积计算

谷氨酰胺含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白浓度计算

谷氨酰胺含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照样本质量计算

谷氨酰胺含量(µg/g鲜重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

谷氨酰胺含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1：加入反应体系中样本体积，1mL；V2：加入提取液体积，2 mL；V3：加入血清（浆）或细胞培养液体积，0.2 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1000：细菌或细胞总数，1000万。

  谷氨酰胺(Glutamine)分光光度法测定试剂盒

注意：

1、该试剂盒仅适用于发酵液或组织中谷氨酰胺含量测定，检测下限为100µg/mL。

2、标准曲线线性范围为：100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA线性范围为：0.01-2；若大于2则需要将上清液用试剂一稀释至适当倍数后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

  谷氨酰胺(Glutamine)分光光度法测定试剂盒